Péptidos antimicrobianos de origen vegetal con potencial terapéutico
La Facultad de Agronomía (Fagro) en conjunto con la Facultad de Química (Fq) y la Facultad de Ciencia (Fcien) llevaron a cabo un proyecto de investigación en el marco del financiamiento ANII-Fondo María Viñas Modalidad II, el cual se título Péptidos antimicrobianos recombinantes de origen vegetal con potencial terapéutico: Rediseño y escalado, y tuvo como principal objetivo avanzar en las etapas de desarrollo de nuevos compuestos para tratamiento, diagnóstico y prevención de enfermedades en humanos, animales y plantas, a partir de péptidos antimicrobianos recombinantes de origen vegetal.
La responsable técnico-científico del proyecto fue la Lic. Bioq. (Dra.) Susana Rodríguez y contó con la contratación de la investigadora Milagros Zerpa. Además, participaron los investigadores e investigadoras Mariana Barraco, Diana Pérez, Roberto Castro, Gianna Cecchetto, Caterina Ruffo y María Lorenzo.
El proyecto finalizó en octubre del año 2024 y los resultados del mismo fueron presentados en un congreso nacional y otro internacional, además se encuentra en redacción el manuscrito para que los resultados sean publicados en revista arbitrada.
En este proyecto se formaron recursos humanos que se han incorporado a esta línea de investigación que actualmente cuenta con el equipamiento y todos los insumos necesarios para la producción de proteínas recombinantes en el Laboratorio de Biotecnología de Fagro.
Resumen
El desarrollo de resistencia a drogas por parte de microorganismos patógenos, ha llevado a la búsqueda constante de nuevos compuestos. Los péptidos antimicrobianos (AMPs), componentes del sistema inmune innato de todos los organismos, se encuentran entre las moléculas más prometedoras para el desarrollo de nuevos fármacos de control, diagnóstico o prevención de infecciones por su rápida acción y bajas posibilidades de desarrollar resistencia. Diferentes aplicaciones terapéuticas de estos compuestos han sido propuestas, desde administración tópica hasta tratamientos sistémicos de las infecciones, además de su uso potencial en imagenología, en terapias anti-cáncer y como adyuvantes vacunales. Las plantas han demostrado ser una fuente importante de nuevos compuestos, entre los que se destacan péptidos antimicrobianos de dos familias: defensinas y esnaquinas. Su producción recombinante (mediante estrategias biotecnológicas) permite disminuir costos asociados a la purificación directa de las plantas, permitiendo además la modificación y optimización de estos péptidos, de manera de obtener variantes mejoradas. Nuestro equipo de trabajo ha producido de forma recombinante, tres péptidos de las plantas nativas Ibirapitá, Ceibo y Congorosa (dos defensinas y una esnaquina). Estos péptidos presentan actividad contra patógenos vegetales y humanos, destacándose dos hongos oportunistas: Candida albicans y Aspergillus niger.
En este proyecto, se propuso aumentar su rendimiento de producción, obteniendo mayores cantidades a menor costo, para finalmente pasar a una producción a mayor escala. Se evaluó además su posible toxicidad, su estabilidad y su comportamiento frente a patógenos humanos alimentarios y patógenos vegetales. Los péptidos producidos se utilizarán en proyectos enfocados en el estudio de sus mecanismos de acción, además de futuras líneas de investigación que evalúen su potencial aplicabilidad (tratamiento de diferentes tipos de infecciones en humanos y animales, adyuvantes de vacunas, reducción de la formación de biofilms, control de patógenos en producción agropecuaria, conservación de alimentos).
Objetivos
El objetivo de este trabajo fue avanzar en las etapas de desarrollo de nuevos compuestos para tratamiento, diagnóstico y prevención de enfermedades en humanos, animales y plantas, a partir de péptidos antimicrobianos recombinantes de origen vegetal. Fue objetivo de esta propuesta incrementar la cantidad de proteína producida y disminuir los costos mediante optimización de las variables para el aumento de su producción. Otros requisitos para su potencial aplicabilidad son: estabilidad y no toxicidad por lo que se planteó también, evaluar la estabilidad de los péptidos recombinantes a temperatura corporal y su posible toxicidad. Por otro lado, demostrar que estos péptidos tienen un amplio rango de actividad contra diversos patógenos amplía su potencial uso en diferentes áreas, por lo que se extendió el número de patógenos evaluados.
Resultados
- En los nuevos sistemas de producción recombinante vector/cepa E coli ensayados, se logró optimizar la producción de los tres péptidos recombinantes, obteniendo todos los péptidos en las fracciones solubles y en cantidades adecuadas para su purificación.
- Comparando las concentraciones obtenidas previamente a este proyecto, se obtuvo un mayor rendimiento y se redujeron los costos de producción en comparación con el sistema utilizado anteriormente, ya que se obtuvieron los péptidos producidos con un rendimiento ~ 10 veces mayor al obtenido previamente
- Los péptidos unidos a GFP mantienen la actividad antimicrobiana (en un porcentaje menor) por lo que se podrían usar para analizar el modo de acción de los mismos mediante microscopía confocal.
- Los ensayos de estabilidad a 37°C no mostraron diferencias en la actividad entre los péptidos almacenados a 37°C (temperatura corporal de mamíferos) y los péptidos controles (guardados en freezer).
- Para la bacteria E. coli STEC O157:H7 se detectó una inhibición de la actividad de entre 6 y 13 % para la concentración más alta de los péptidos. Estos ensayos deberían repetirse ya que, si bien el % de inhibición es bajo, esta bacteria es importante por ser una E. coli productora de toxina Shiga que puede producir diarreas y en algunas personas infectadas, el síndrome urémico hemolítico, una complicación grave, que puede dañar los riñones y otros órganos.
- Con los valores encontrados en los ensayos de actividad lítica de glóbulos rojos de conejo podemos decir que, en ninguno de los péptidos, la actividad hemolítica fue importante, por lo que su uso en cultivos, animales y humanos parece seguro. Ensayos adicionales son necesarios para confirmar su seguridad.
- El péptido PdSN1-His6 presenta actividad contra los fitopatógenos Botritis cinérea y Colletotrichum spp.
- Los resultados mostraron que el método de screening que se puso a punto, utilizando una construcción que produce el péptido con el extremo C-terminal libre, es un método rápido y económico para la evaluación inicial de la actividad antimicrobiana, lo que permite el análisis de un mayor número de péptidos.
Publicaciones
- Zerpa, M, Perez, D, Rufo, C, Barraco-vega, M, Castro, R, Cecchetto, G., RODRÍGUEZ-DECUADRO, S. 2024. Optimización de la producción de péptidos antimicrobianos recombinantes de plantas silvestres y evaluación de su potencial terapéutico. Evento: Internacional. International Congress of Chemistry, Biochemistry and Chemical Engineering, QuimiCuba. Ciudad: La Habana, Cuba.
- Zerpa, M, RODRÍGUEZ-DECUADRO, S. 2024. Evaluación de la actividad de un péptido antimicrobiano de Ibirapitá utilizando diferentes vectores de expresión para su producción recombinante. Evento: Nacional. XIV Jornadas de la Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular. Ciudad: Montevideo. https://www.sbbm.edu.uy/_files/ugd/83a84f_532b42daaf72487fa07daf052b3fc41a.pdf
- Zerpa, M, Perez, D, Rufo, C, Barraco-vega, M, Castro, R, Cecchetto, G., RODRÍGUEZ-DECUADRO, S. Evaluation of two expression vectors to improve recombinant AMP production in Escherichia coli. En etapa de redacción. Será enviado a la revista arbitrada.
